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取对数生长期的细胞制成悬液,接种至96孔板,每孔μL,于5%CO2,37℃培养24h,然后分别加入不同浓度的多肽溶液,每个浓度设3个平行孔,同时设加PBS的对照组,置5%CO2,37℃培养箱中孵育,培养结束后,加PBS洗2遍,然后加MTT继续培养4h,洗去MTT,加DMSO充分震荡后置酶联免疫检测仪在nm测吸光度,计算细胞增殖抑制率。
1.3.3石金钱龟多肽液对肿瘤细胞周期的影响
取对数生长期的MCF-7,MDA-MB-肿瘤细胞制成细胞悬液(1×个/ml),加入24孔培养板中培养,24h后加入不同稀释度的石金钱龟多肽,每个浓度设3个复孔,再继续培养24h。
用PBS液洗2次,用预冷的75%乙醇固定,加入碘化丙啶,置4℃避光染色50min,过目尼龙网,用流式细胞仪测定细胞的周期分布。
02结果与分析
2.1石金钱龟多肽的抗肿瘤活性
采用MTT法检测石金钱龟多肽对MDA-MB-,Hela,SGC-,COLO-,MCF-7,Hep-G2,PC-3,K,A-,A-等肿瘤细胞作用24h后的增殖抑制率,结果见表1。
石金钱龟多肽对乳腺癌细胞株MDA-MB-和MCF-7细胞具有较好的增殖抑制效果,当浓度为25mg/mL时,对MDA-MB-及MC-7的抑制率分别为62.07%和70.37%;对Hela及COLO-细胞抑制活性较差,浓度为mg/mL时,抑制率仅为48.10%及46.04%;且石金钱龟多肽对MDA-MB-、MCF-7、Hep-G2、PC-3、K等的抑制活性呈现浓度依赖性,实验中当石金钱龟多肽的浓度为1、2mg/mL时,对10种细胞均没有增殖抑制效果。
▼表1不同浓度石金钱龟多肽对10种肿瘤细胞的增殖抑制
Tab.1Effectofpeptideonproliferationoftenkindsofcelllines
细胞种类不同浓度(mg/mL)时的抑制率(%)6..52550
MDA-MB
24.91±1..39±3.4.07±5..87±7..87±8..80±8..01±9.01
Hela
4.62±0..84±0..85±0..96±1..97±3..42±4..10±4.12SGC-
4.41±0..30±0..10±1..78±2..47±3..43±4..45±7.09
COLO-
4.03±0..38±0..09±1..53±1..92±2..72±3..04±4.35
MCF-7
35.81±3..86±4..37±7..50±8..28±8..84±9..30±9.91
Hep-G2
4.88±0..00±0..53±1..48±2..89±3..74±4..27±6.56
PC-3
10.30±1..68±1..63±1..46±2..35±3..50±3..86±6.96
K
6.65±0..85±1.0.27±1..25±2..39±4..82±5..99±7.31
A-
12.74±1..33±1..83±3..27±4..78±5..84±5..80±8.02
A-
17.45±1..79±2..59±3..45±4..45±4..02±5..10±7.29
2.2石金钱龟多肽液对肿瘤细胞周期的影响
用流式细胞仪分别观察石金钱龟多肽液对MDA-MB-及MCF-7肿瘤细胞作用24h后,各组细胞周期的变化,发现石金钱龟多肽液对MDA-MB-细胞发生G2-M期阻滞,而MCF-7细胞发生S期阻滞。
03结 论
本实验研究了石金钱龟多肽对10种肿瘤细胞的增殖抑制活性,结果表明,石金钱龟多肽对乳腺癌细胞系的MDA-MB-和MCF-7细胞表现出了很强的细胞增殖抑制活性,而对Hela,COLO-肿瘤细胞没有显著活性。对MDA-MB-,SGC-,Hep-G2,PC-3,K,A-,A-等细胞具有较好的抑制活性,在多肽浓度达到mg/mL时抑制率均达到68%以上。实验发现石金钱龟多肽对MDA-MB-及MCF-7肿瘤细胞的细胞周期有一定的影响,对MDA-MB-细胞的G2-M期发生阻滞,而对MCF-7细胞发生S期阻滞。
专家指出,由于肿瘤细胞有其特殊的生长模式,如无限复制、可以对生长信号进行自我调节,对外界生长抑制信号敏感性较差,以及具有极强的抗细胞凋亡能力,可以自主调控供给营养血管的生成和免疫逃逸等特性,使一般的抗肿瘤药物很难达到较好的杀死肿瘤细胞的功效。而肽类对肿瘤具有较好的亲和力和较强的特异性以及以肽为基础的治疗,与其它小分子化学药物及抗体相比,由于他们体积微小,因此更容易渗透到组织中,再者就是多肽类具有低*性等优点,还可以增加对肿瘤治疗的敏感度,因此成为近年来抗肿瘤治疗新型抗癌方法研究的热点之一。虽然多肽类化合物具有一定的活性,尤其是在抗肿瘤方面,但版药典收录的多肽药物仅有20多种,且皆是国外的已过专利保护期或未在我国申请专利的药物,而抗肿瘤肽仅有一种(醋酸奥曲肽),因此开发出具有自主知识产权的抗肿瘤多肽药物也成为多肽研发的一个热点。因此科研人员希望在极少得肿瘤的动物中获得某些有抗肿瘤活性的多肽并对其抗肿瘤活性及其机理进行研究,以期开发出具有自主知识产权的抗肿瘤多肽药物。由于石金钱龟属于从不得肿瘤的动物,不少科研人员均将其作为科学研究对象。暨南大学药学院中药及天然药物研究所、暨南大学理工学院食品科学与工程系、深圳凯联健康科技有限公司捷足先登并取得重大突破,取得了不同浓度石金钱龟多肽对10种肿瘤细胞的增殖都有抑制作用的科研成果,对于提高防癌抗癌成效、造福百姓、促进健康中国建设和龟业发展,都具有重大意义!
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